Titolo del progetto: Trasferimento di modelli di degenerazione cellulare non-cell-autonomous tra EU e USA per sviluppare una terapia efficace per le malattie del motoneurone (MND)

Il progetto è un programma collaborativo finanziato da Marie Curie International Research Staff Exchange Scheme con lo scopo di sviluppare una terapia efficace per le MND le attraverso lo scambio di conoscenze, tecnologie e persone tra EU e USA.

SCOPO DEL PROGETTO

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e l’atrofia muscolare spinale (SMA) sono due malattie neurologiche ad esito fatale caratterizzate da una selettiva degenerazione dei motoneuroni attualmente senza una cura efficace. Le cellule non neuronali come gli astrociti giocano un ruolo fondamentale nella patogenesi della SLA e della SMA. Comprendere i meccanismi di morte cellulare causati dalle cellule non neuronali può portare alla scoperta di nuovi target terapeutici per queste patologie. Questo progetto ha lo scopo di approfondire la conoscenza della morte cellulare non-cell-autonomous nelle patologie del motoneurone tramite lo scambio di conoscenze e persone tra i 2 enti europei (Italia e Grecia) e 1 ente americano. Il programma ha diversi obiettivi: 1) sviluppare un modello di malattia in vitro per studiare le interazioni molecolari tra le cellule non neuronali e i motoneuroni usando la tecnologia della riprogrammazione; 2) studiare l’efficacia del potenziale terapeutico del trapianto di cellule non neuronali nei modelli di malattia motoneuronale. Il progetto prevede 4 anni di scambio di ricercatori tra le unità coinvolte. I 3 gruppi hanno una consolidata esperienza nel campo delle malattie motoneuronali, nei modelli in vivo e in vitro, nello studio dei meccanismi e nella terapia cellulare. I vari progetti di ricerca sono supportati grazie a diversi grant. Il progetto IRSES fornisce l’opportunità di scambiare conoscenze tra EU e USA.

Partners

• Università degli Studi di Milano, Laboratorio di cellule staminali neurali

Il Laboratorio di Cellule Staminali Neurali costituisce una delle strutture di ricerca del Centro Dino Ferrari e dell’Università degli Studi di Milano ed ha sede presso la Palazzina Sforza della Fondazione Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico. Il gruppo di ricerca, PI Dr. Stefania Corti, è impegnato nello sviluppo di strategie terapeutiche cellulari e molecolari per patologie neurodegenerative (in particolare malattie del motoneurone ad esordio infantile – Atrofia Muscolare Spinale e Atrofia muscolare spinale con distress respiratorio – o adulto come la Sclerosi Laterale Amiotrofica) e neuropatie ereditarie (Malattia di Charcot-Marie-Tooth 2 di tipo 2A).

• Accademia di Atene, Fondazione di Ricerca Biomedical

L’istituto di ricerca si occupa di patologie neurodegenerative, come la Malattia di Parkinson, M. di Alzheimer, la Corea di Huntington e la Sclerosi Laterale Amiotrofica. In particolare le richerche scientifiche sono focalizzate sui meccanismi attraverso cui queste patologie si propagano nel sistema nervoso centrale, con la speranza di identificare potenziali target terapeutici. I meccanismi patologici principalmente studiati includono proteine misfolded, aggregazione di proteine, formazioni di inclusioni o dissoluzioni di aggregati proteici, danni nel sistema di degradazione di proteine, disfunzioni sinaptiche e morte cellulare. Il gruppo che collabora al progetto, diretto dal Porf. L. Stefanias, si dedica soprattutto allo studio del M. Parkinson e in particolare si propone l’obbiettivo di decifrare il legame tra il difetto genetico e la patologia utilizzando sia modelli cellulari che animali. I modelli sono basati sui difetti genetici al associati alla M. di Parkinson, ma includono anche altre patologie con patogenesi neurotossica (MPTP). I pathway biochimici rilevati in questi modelli sono poi esaminati in materiale biologico derivato da pazienti e le conoscenze molecolari ottenute dallo studio dei pazienti sono usate per lo sviluppo di nuovi modelli di malattia.

• Columbia University, Motor Neuron Center for Neurobiology and Disease

Il Motor Neuron Center è un Istituto di Ricerca della Columbia University di New York dedicato allo studio delle malattie del motoneurone. Il laboratorio del Prof. Serge Przedborski è partner del progetto e il coordinatore della collaborazione è la Prof. Diane Re. Il Prof. Przedborski è professore di Neurologia e Patologia ed è co-direttore del Motor Neuron Center (http://www.columbiamnc.org/bio.php?id=4). La ricerca svolta nel suo laboratorio è volta allo studio delle basi molecolari di neurodegenerazione e di strategie terapeutiche.

Questo laboratorio ha concentrato la sua ricerca sul modello animale di SLA basato sull’espressione del gene mutato della superossido dismutasi (SOD). Nell’ultimo decennio il Prof. Przedborski ha studiato i pathways apoptotici che coinvolge i motoneuroni evidenziando che la morte cellulare programmata gioca un ruolo importante nella degenerazione dei motoneuroni nella SLA. I risultati di questi studi sono stati resi noti in diverse pubblicazioni scientifiche.

Descrizione del progetto

Obiettivi

• Obiettivo 1: Gestione del progetto e coordinazione tra i vari enti partecipanti

Scopo: Rispettare gli obiettivi e le tempistiche approvatedel progetto; sviluppare soluzioni per ogni eventuale deviazione dal piano del progetto.

Descrizione del lavoro

1.1 – Gestione del progetto: Assicurarsi che gli obiettivi a breve termine del progetto siano raggiunti; interazione con la commissione; gestire i rischi del progetto, facilitare le comunicazioni tra tutti i membri del consorzio; organizzare incontri regolari per lo scambio dei progressi scientifici e discutere eventuali difficoltà. Oltre ai seminari che saranno tenuti sistematicamente dai ricercatori durante i periodi di scambio, saranno organizzati incontri specifici per lo scambio di conoscenze e risultati tra tutti i 3 partner (Milano/Atene/New York).

1.2 – IPR e gestione finanziaria: gestione del budget; assicurarsi che le risorse siano utilizzate nel modo corretto; gestire IPR.

1.3 – Supervisione degli scambi di persone: supervisione e registro dello scambio ricercatori; organizzazione pratica per il viaggio e l’alloggio. Il coordinatore sarà supportato dagli altri manager; aggiornamenti sugli specifici aspetti del progetto avverranno con skype e email. Garantire che i ricercatori lavorino in un ambiente sano.

• Obiettivo 2: Ottenere astrociti riprogrammando fibroblasti di pazienti SLA come modello in vitro e per lo sviluppo di una strategia terapeutica

Scopo: Stabilizzare un modello in vitro di origine umana di SLA per studiare i meccanismi di tossicità degli astrociti sui motoneuroni e determinare se la modificazione genetica degli astrociti o dei motoneuroni possa essere utilizzata come possibile strategia terapeutica. Utilizzare questo modello per un high-throughput screening di farmaci.

Descrizione del lavoro

2.1 – Gli astrociti (ASTRO) saranno derivati da due fonti: dalla riprogrammazione di fibroblasti di pazienti SALS/FALS in iPSC o tramite trans-differenziamento diretto. Lo sviluppo di un metodo per generare astrociti SLA puri da utilizzare in coltura con i motoneuroni è l’obiettivo principale di questa parte del progetto.

2.2 – Stabilire un modello in vitro di SLA basato sulla co-coltura di SALS/FALS ASTRO e motoneuroni. Questo modello servirà a dimostrare che gli astrociti SALS esercitano una morte con meccanismo non autonomo sui motoneuroni.

2.3 – Studio dei meccanismi non autonomi che inducono la morte negli ASTRO: Per investigare i meccanismi degli astrociti mediati da eventi non autonomi ci focalizzeremo su due strategie: 1) analisi di espressione genica degli ASTRO usando next generation sequencing (RNASeq) per analizzare il trascrittoma ed identificare i potenziali target terapeutici responsabili della tossicità; 2) Validazione dei cambiamenti dei livelli di espressione negli ASTRO malati tramite PCR quantitativa e western blot.

2.4 – Test delle possibili strategie terapeutiche nei modelli di co-coltura di ASTRO-SLA e motoneuroni SLA: Analizzeremo il ruolo dei geni differenzialmente espressi negli ASTRO-SLA (identificati nel task 2.3) overesprimendoli o silenziandoli prima di metterli in co-coltura con i motoneuroni.

• Obiettivo 3: Tossicità degli astrociti sui motoneuroni (MN) SMA.

Scopo: Studiare il ruolo delle cellule non neuronali nella degenerazione dei motoneuroni SMA. Valutare se gli astrociti SMA svolgano un effetto tossico ed approfondire i meccanismi di morte cellulare motoneuronale mediata dagli astrociti. Valutare se un approccio terapeutico mirato nei confronti di tale interazione possa essere efficace. Stabilire un valido modello in vitro per lo studio della patogenesi della SMA.

Nell’ambito di questo obiettivo, si terrà a Milano nel maggio 2015 il secondo “incontro giornata NO-MND”. Il tema principale sarà la cascata molecolare che porta alla degenerazione dei MN nell’ambito dell’atrofia muscolare spinale ed altre malattie del motoneurone. Il secondo workshop annuale di 2 giorni si terrà a New York nel settembre 2015 e avrà una particolare enfasi su “Come selezionare ed utilizzare strategie biased ed unbiaised quali reverse Gene Engineering per investigare i meccanismi molecolari di degenerazione”.

Descrizione del lavoro

3.1 – Derivazione di astrociti sia da fibroblasti ottenuti da pazienti SMA e riprogrammati in iPSC sia da cellule direttamente trans-differenziate. Sviluppo di un metodo per la generazione di popolazioni altamente pure di astrociti SMA/wild type da utilizzare in co-coltura con motoneuroni. Un secondo obiettivo è la generazione di motoneuroni derivati da iPSC ottenute dagli stessi soggetti, che possano essere utilizzati in esperimenti di co-coltura.

3.2 – Definizione di un modello di malattia SMA in vitro basato sulla co-coltura di astrociti e motoneuroni SMA umani. Dimostrazione che gli astrociti SMA inducono la morte motoneuronale tramite un meccanismo non autonomo, mediante l’utilizzo di sistemi di co-coltura costituiti da iPSC differenziate in motoneuroni ed astrociti, sia sani che derivati da pazienti SMA in diverse combinazioni.

3.3 – 1) analisi di genome wide expression degli astrociti tramite tecniche di sequenziamento di nuova generazione (RNASeq) di modo da ottenere una valutazione approfondita del trascrittoma astrocitorio ed individuare potenziali bersagli responsabili della tossicità nei confronti dei motoneuroni; 2) Validazione dei livelli differenziali di espressione dei target identificati negli astrociti malati tramite PCR quantitativa e western blot.

3.4 – Valutazione delle possibili strategie terapeutiche nel modello di co-coltura di astrociti e motoneuroni SMA: silenziamento di specifici geni up-regolati negli astrociti SMA di modo da valutare se si verifichi un effetto positivo sui motoneuroni in co-coltura. Espressione di geni bersaglio negli astrociti per valutare eventuali modifiche neuropatologiche e / o neuroprotettive sui motoneuroni in co-coltura.

• Obiettivo 4: trapianto di precursori gliali (GRP) derivati da cellule staminali (IPSC) come strategia terapeutica per la SLA

Scopo: contribuire allo sviluppo di un approccio basato sull’impiego di cellule staminali per il trattamento della SLA. Testare l’efficacia terapeutica ed i meccanismi molecolari legati al trapianto di precursori gliali (GRP) derivati nel modello murino di SLA, (topi SOD1G93A). Trovare nuove terapie per il trattamento delle malattie del motoneurone.

Il terzo “incontro giorno NO-MND” si terrà a New York nel maggio 2016, la tematica principale sarà la promessa e la sfida della terapia basata sulla sostituzione cellulare nell’ambito delle malattie del motoneurone. La terza edizione del workshop di 2 giorni si terrà ad Atene nel mese di settembre 2016 e avrà una particolare enfasi su “come progettare un efficace studio preclinico nel modello murino di SLA e SMA.”

Descrizione del lavoro

4.1 – Stabilire ed ottimizzare un protocollo per l’isolamento dei GRP a partire da iPSC. Le cellule derivate saranno trattate per l’analisi immunocitochimica con anticorpi specifici per i neuroni, gli astrociti, e gli oligodendrociti. Analisi del fenotipo morfologico e dell’espressione genica.

4.2 – Testare il trapianto di GRP in un modello di topo transgenico SLA, definendo il numero ottimale di cellule da trapiantare cui farà seguito un’analisi dose-effetto e l’osservazione della comparsa di eventuali effetti collaterali. Saranno valutati l’attecchimento e l’efficacia terapeutica delle cellule trapiantate, osservando migrazione, sopravvivenza, e corretta integrazione dei GRP nel tessuto ospite e se i GRP danno origine a cellule neuroectodermiche, sostituendo i MN disfunzionali endogeni. Determinare se gli animali SLA trattati presentano un esordio tardivo di malattia

4.3 – Caratterizzazione dei meccanismi alla base degli esiti di trapianto di cellule. Analisi delle interazioni bidirezionali cellulari e molecolari tra cellule staminali trapiantate e MN endogeni ed i meccanismi che portano alla modulazione dei fenotipi di malattia ed alla neuroprotezione dei MNs, valutando la capacità dei GRP trapiantati di esercitare un effetto neuroprotettivo sui MN SLA in vitro e in vivo. Disposizione di sistemi di co-cultura basati su GRP e MN SLA (derivati da IPSC) per chiarire se il trapianto di cellule staminali possa portare alla modulazione del microambiente neuronale, favorendo la sopravvivenza MN endogena.

4.4 – Generazione di GRP da pazienti SLA per uso in vitro e in vivo. Valutazione degli effetti in vivo di GRP da pazienti SLA, tramite la generazione di GRP SLA ed il loro trapianto nel topo wild-type, al fine di ricreare per la prima volta modelli in vivo di morte cellulare non autonoma nella SLA.

• Obiettivo5: trapianto di precursori gliali (GRP) derivate da cellule staminali (IPSC) come strategia terapeutica per la SMA

Scopo: esplorare il potenziale terapeutico di GRP umani derivati da iPSC nel fornire neuroprotezione nell’ambito della SMA. Trapianto di GRP in topi SMA con determinazione della sopravvivenza, della differenziazione e delle proprietà dei GRP dopo il trapianto. Determinare la capacità delle cellule trapiantate di proteggere i motoneuroni e studiare le proprietà dei GRP, quali la loro capacità di produrre fattori di crescita sia prima che dopo il trapianto. Questi esperimenti saranno volti anche ad individuare altri potenziali meccanismi neuroprotettivi. Valutazione della capacità di GRP wild-type di proteggere i motoneuroni e le giunzioni neuromuscolari (NMJs) e di aumentare quindi la forza muscolare e la sopravvivenza dopo il trapianto in topi SMA.

Il quarto workshop annuale di 2 giorni si terrà a Milano nel maggio 2017 ed avrà una particolare enfasi su “Le basi dell’high-throughput screening ad alto rendimento per i farmaci neuroprotettivi” Il quarto “incontro giornata NO-MND” si terrà ad Atene nel settembre 2017. Il tema principale sarà ” strategie terapeutiche combinate per le malattie del motoneurone.”

Descrizione del lavoro

5.1 – Stabilire ed ottimizzare il protocollo in vitro per la generazione di GRP a partire da iPSCs.

5.2 – Testare il trapianto dei GRP in un modello di topo transgenico di SMA (il topo SMA ∆7) di modo da definire un numero ottimale di cellule da trapiantare, effettuando un’analisi dose-effetto ed indagando il verificarsi di eventuali effetti collaterali. Valutazione dell’attecchimento e dell’efficacia terapeutica delle cellule trapiantate andando a determinare se i GRP contribuiscono a fornire cellule neuroectodermiche, sostituendo i MN disfunzionali endogeni. Analisi dei topi SMA transgenici trattati, con valutazione del tempo d’insorgenza della malattia, del miglioramento della funzione neuromuscolare, e dell’aumento della sopravvivenza accompagnata da ridotta perdita di MN.

5.3 – Caratterizzazione dei meccanismi alla base degli esiti di trapianto di cellule. Analisi delle interazioni bidirezionali cellulari e molecolari tra cellule staminali trapiantate e MN endogeni ed i meccanismi che portano alla modulazione dei fenotipi di malattia ed alla neuroprotezione dei MNs, valutando la capacità dei GRP trapiantati di esercitare un effetto neuroprotettivo sui MN SMA in vitro e in vivo. Disposizione di sistemi di co-cultura basati su GRP e MN SMA (derivati da IPSC) per chiarire se il trapianto di cellule staminali possa portare alla modulazione del microambiente neuronale, favorendo la sopravvivenza MN endogena.

5.4 – Generazione di GRP da pazienti SMA per ulteriori utilizzi in vitro e in vivo. Valutazione degli effetti in vivo di GRP da pazienti SMA, tramite la generazione di GRP SMA ed il loro trapianto nel topo wild type, al fine di ricreare per la prima volta modelli in vivo di morte cellulare non autonoma nella SMA.

• Obiettivo 6: attività di formazione e divulgazione

Scopo: diffondere la documentazione prodotta e gli strumenti sviluppati dai partner del progetto. Fornire video di formazione e documentazione con vari livelli di dettaglio, utili sia per l’utente interessato che per il ricercatore.

Descrizione del lavoro

6.1 – (In situ e on-line) sessioni di formazione a distanza per gli utenti e di ricercatori. Progettazione e sviluppo della documentazione volta alla formazione assemblando il materiale derivato dai diversi WP con nuovo materiale in vitro ed in vivo. Organizzazione di video conferenze ogni 2 o 3 mesi; i ricercatori in scambio terranno seminari scientifici sul lavoro svolto per l’istituto ospitante.